液相色譜法檢測棉籽粕中的氨基酸

摘要：采用柱前衍生反相液相色譜法分析棉籽粕中十八中氨基酸，衍生試劑為優(yōu)選的某試劑，流動相為醋酸鹽緩沖溶液、乙腈、水，二元梯度洗脫，色譜柱為AAK氨基酸柱，紫外檢測。該方法使用液相色譜儀，定性重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確。

    關(guān)鍵詞：液相色譜、氨基酸、棉籽粕

*，蛋白質(zhì)是飼料中zui主要的營養(yǎng)指標(biāo)之一，動物通過從飼料中攫取蛋白質(zhì)，在其腸道中被分解成氨基酸而被機(jī)體吸收，從而合成自身的蛋白質(zhì)，滿足機(jī)體自身的生長發(fā)育的需要，因此，飼料中充足的蛋白質(zhì)有利于動物機(jī)體充分發(fā)揮生長潛能。由于蛋白質(zhì)飼料營養(yǎng)價值zui為根本的決定因素是其氨基酸組成，因此近年來越來越多的企業(yè)注重對蛋白質(zhì)飼料氨基酸組成的分析，從氨基酸水平上評估蛋白質(zhì)飼料及配合飼料的品質(zhì)。

我國長江、黃河中下游和新疆地區(qū)為棉花主產(chǎn)區(qū)，每年可提供約600萬噸棉籽，制油后棉籽餅粕總產(chǎn)量約300萬噸，故棉籽粕是我國重要的蛋白質(zhì)飼料資源。棉籽粕含有的粗蛋白可達(dá)40%以上。棉籽粕作為蛋白質(zhì)飼料的主要資源之一，除了要關(guān)注它的蛋白質(zhì)含量，對其氨基酸組成的分析也成為關(guān)注的焦點。

目前，飼料中氨基酸的測定主要是根據(jù)GB/T 18246-2000 《飼料中氨基酸的測定》方法來測定的，該方法是利用氨基酸分析儀來測定的，且對各種不同的氨基酸前處理方法不同，前處理方法比較復(fù)雜。

本文利用優(yōu)選的衍生試劑，通過柱前衍生，利用液相色譜來分析棉籽粕中的十八種氨基酸。

1         實驗部分

1.1    儀器及試劑

1.1.1         試劑及試劑的配制

1.1.1.1    乙腈（色譜純）；

1.1.1.2 水（超純水）；

1.1.1.3 醋酸鈉（分析純）；

1.1.1.4 冰乙酸（分析純）；

1.1.1.5 *（分析純）；

1.1.1.6 N，N-二甲基甲酰胺（分析純）；

1.1.1.7 碳酸氫鈉（優(yōu)級純）；

1.1.1.8 磷酸二氫鉀（優(yōu)級純）；

1.1.1.9 氫氧化鈉（優(yōu)級純）；

1.1.1.10 色氨酸標(biāo)樣（中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；

1.1.1.11 17種氨基酸混合標(biāo)樣（中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，混合標(biāo)樣中17種氨基酸的濃度見表一）；

表一 十七種氨基酸標(biāo)樣中各氨基酸濃度

1.1.1.12 飼料參比（中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，飼料參比的百分含量見表二）；

表二 飼料參比的百分含量

1.1.1.13 色氨酸標(biāo)樣配制：稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉溶液溶解配制成濃度為2μmol/mL溶液，即20.42mg/100mL；

1.1.1.14 6 mol/L鹽酸配制：用濃鹽酸和水1：1配置即可；

1.1.1.15 5 mol/L氫氧化鈉的配制：稱取200g氫氧化鈉配成1L水溶液；

1.1.1.16 0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取0.4g氫氧化鈉配成100mL水溶液；

1.1.1.17 衍生緩沖液：4%碳酸氫鈉水溶液；

1.1.1.18 衍生試劑：適量衍生試劑用乙腈定容為100mL；

1.1.1.19 平衡緩沖液：0.68%磷酸二氫鉀水溶液。

1.1.2 儀器

液相色譜儀

大連依利特AAK氨基酸柱（4.6mm×250mm）

水解管：硬質(zhì)玻璃管，體積20～30mL

恒溫干燥箱、真空泵、漩渦混勻器、酒精噴燈等

1.2    儀器條件

檢 測 器：紫外可見檢測器；

檢測波長：360nm；

色 譜 柱： AAK氨基酸柱（4.6mm×250mm）；

流 動 相：流動相A：乙腈：水＝1：1；

流動相 B：0.05mol/L醋酸鈉溶液（稱取4.1g醋酸鈉，0.4g*，加水900mL溶解，加入10mL N，N－二甲基甲酰胺，用冰乙酸調(diào)pH值為6.4，用水定容為1000mL）；

流速：1.2mL/min；

柱溫：27℃；

進(jìn)樣量：20μL。

表三 梯度洗脫時間表

1.3    樣品處理過程

1.3.1 樣品和飼料參比水解：

1.3.1.1 對于除色氨酸以外的十七種氨基酸用酸水解：準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量，使樣品氨基酸總量在約100mg范圍內(nèi)，置于水解管中，加入6mol/L鹽酸10mL左右，用酒精    

噴燈封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷卻后，打開水解管封口，將水解液全部用濾紙過濾到50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，供衍生使用。

1.3.1.2 對于色氨酸用堿水解：準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量，使樣品氨基酸總量在約100mg范圍內(nèi)，置于于水解管中，加入5mol/L氫氧化鈉10mL左右，放置30min以后，用酒精噴燈封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷卻后，將水解液全部轉(zhuǎn)移到50mL的容量瓶中，先用6mol/L鹽酸10mL左右中和，再用水定容至刻度，混勻，供衍生使用。

1.3.1.3 由于酸水解過程中含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）部分被氧化不能測準(zhǔn)，所以要用飼料參比來加以校正，飼料參比用酸水解：準(zhǔn)確稱量粉碎混勻的樣品適量，使樣品氨基酸總量在60～100mg范圍內(nèi)，置于水解管中，加入6mol/L鹽酸10mL左右，用酒精噴燈封口，然后放入145℃的烘箱中水解4h，取出冷卻后，打開水解管封口，將水解液全部用濾紙過濾到50mL的容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，供衍生使用。

1.3.2 標(biāo)樣和樣品衍生

1.3.2.1 十七種氨基酸標(biāo)樣、飼料參比和樣品酸水解的水解液的衍生過程：用注射器準(zhǔn)確吸取樣品水解液適量于小試管底部中；將小試管置于真空瓶或者真空干燥器中，抽干；用移液槍加入適量衍生緩沖液，漩渦混合；用移液槍加入定量衍生試劑，漩渦混合，用封口膜封口，置于60℃烘箱中反應(yīng)30min；取出冷卻后用移液槍加入160μL平衡緩沖液，漩渦混合，取20μL進(jìn)樣。

1.3.2.2 色氨酸標(biāo)樣、樣品堿水解的水解液的衍生過程：用注射器準(zhǔn)確吸取樣品水解液適量于小試管底部；將小試管置于真空瓶或者真空干燥器中，抽干；用移液槍加入適量衍生緩沖液，漩渦混合；用移液槍加入定量衍生試劑，漩渦混合，用封口膜封口，置于60℃烘箱中反應(yīng)30min；取出冷卻后用移液槍加入160μL平衡緩沖液，漩渦混合，取20μL進(jìn)樣。

2         結(jié)果與討論

2.1 專屬性

圖一 十七種氨基酸的色譜圖

十七種氨基酸的出峰順序：1、天冬氨酸；2、谷氨酸；3、絲氨酸；4、精氨酸；5、甘氨酸；6、蘇氨酸；7、脯氨酸；8、丙氨酸；9、纈氨酸；10、蛋氨酸；11、胱氨酸；12、異亮氨酸；13、亮氨酸；14、苯丙氨酸；15、組氨酸；16、賴氨酸；17、酪氨酸。

從圖一中可以看出，除了苯丙氨酸和組氨酸沒有分開之外，其余各峰均分離良好，苯丙氨酸和組氨酸可以用切分峰的方法進(jìn)行計算。

2.2 飼料參比的作用

由于酸水解過程中含硫氨基酸（半胱氨酸和蛋氨酸）部分被氧化而不能測準(zhǔn)，所以要用飼料參比來加以校正。校正的方法是，通過用飼料參比中蛋氨酸和半胱氨酸的含量來校正標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的濃度含量，從而使得標(biāo)樣中蛋氨酸和半胱氨酸的含量準(zhǔn)確，再用標(biāo)樣去定量樣品中氨基酸含量。

2.3 色氨酸的檢測

    色氨酸用提供的色譜條件就可以進(jìn)行檢測，可以得到分離良好的色譜圖，如圖二所示：

圖二 色氨酸色譜圖

2.4 棉籽粕樣品的分析結(jié)果

新疆棉籽粕的粗蛋白含量基本在42%~46%之間，此類棉籽粕的粗蛋白含量是很高的，很適合于做蛋白質(zhì)飼料，能夠測出此類棉籽粕的各種氨基酸的含量，尤其是必需氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸等）的含量，可以以此來評價棉粕的品質(zhì)，并且可以為配合氨基酸成分平衡的飼料提供參考依據(jù)。表三 為新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果。

表四  新疆金鑫科技棉籽粕樣品的氨基酸分析結(jié)果

3         結(jié)論

    通過酸水解前處理的方法和飼料參比校正的數(shù)據(jù)處理可以同時檢測棉籽粕中十七種氨基酸，通過堿水解的方法可以檢測棉籽粕中的色氨酸。該衍生化方法簡便、產(chǎn)物穩(wěn)定，過量的衍生化試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物對檢測沒有影響。二元高壓系統(tǒng)流量精度高，保留時間重復(fù)性好，紫外檢測器性能穩(wěn)定。該方法可廣泛應(yīng)用于飼料、食品、生化、醫(yī)藥等分析領(lǐng)域。