蜂蜜中糖含量分析方法的確定及問題分析

測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖

適用于該項目的國標有GB/T 22221-2008和GB/T18932.22-2003, 實驗室沒有GB/T18932.22-2003標準中規(guī)定的色譜柱，而GB/T 22221-2008標準中規(guī)定的條件都能滿足，就先按照GB/T 22221-2008標準的方法進行樣品前處理和儀器分析。

2 實驗部分
2.1儀器及試劑
Waters e2695液相色譜儀、2414示差折光檢測器；果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖均為分析純；乙腈，色譜純；實驗用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得，18MΩ•cm，25 ℃
2.2儀器分析條件—參照GB/T 22221-2008標準方法設定
色譜柱：CNW Athena NH₂ (250mm×4.6mm, 5μm)；流動相：乙腈：水=85：15；流速：1.0mL/min；進樣體積：20μL；色譜柱溫度：40℃；檢測器溫度：40℃
2.3 標準溶液的配制
分別準確稱取一定質(zhì)量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖用水溶解并定容至100mL，配成濃度為5g/100mL的標準儲備溶液。
由于是條件摸索階段，因此不急于配制系列標準溶液，先配制一個較高濃度的混合標準溶液（1g/100mL）用于確定儀器分析條件和標準曲線范圍。
3 遇到的問題與分析
3.1 儀器分析條件的優(yōu)化及單標確認
按照上述儀器分析方法對濃度為1g/100mL的混合標準溶液進行測定，測定結果見圖1。

從圖中可以看出，雖然4種糖的混合標準溶液色譜圖中對應出現(xiàn)4個色譜峰，但是卻存在以下幾個問題：
（1） 該色譜條件下4種組分的分離時間較長，4種組分*分離需要近35min，各組分之間的分離度較大，可以嘗試進行條件優(yōu)化，縮短檢測時間；
（2） 相同濃度下4種組分的出峰響應值相差較大，配制混合標準溶液時可以依據(jù)樣品中的含量適當降低組分1或者增加其它組分的濃度；
（3） 基線噪音較大，不利于微量組分的分析，對樣品的定性和定量都會產(chǎn)生影響
針對上述問題，決定先嘗試優(yōu)化儀器分析條件，縮短樣品測試時間?；旌蠘藴嗜芤旱臐舛仍谏V柱和儀器的耐受范圍內(nèi)，由于是條件摸索階段，因此暫時先不調(diào)整，仍然采用該濃度的混合標準溶液進行分析。分析條件中采用的是示差檢測器，該檢測器不允許進行梯度洗脫，要改善分離條件縮短測試時間只能從流動相上做文章，于是嘗試通過改變流動相比例進行優(yōu)化。氨基色譜柱既可以用于正相模式反相模式，又可以用于反相模式，在正相模式下，可以代替硅膠柱使用；在反相模式下可用于碳水化合物的分析，尤其適用于糖類分析，本實驗即是采用氨基色譜柱的反相模式進行糖類分析。實驗中發(fā)現(xiàn)微調(diào)流動相中有機相的含量，各組分間的分離度有很大的變化。增加乙腈的比例能夠提高各組分間的分離度，但測試時間延長；降低乙腈的比例會降低各組分的分離度，但卻很大程度上縮短了測試時間。當流動相為乙腈：水=75：25時，4種糖的測定時間縮短至15 min，同時4種糖具有較好的分離度。

上述測試過程中使用的是4種糖的混合標準溶液，每個峰對應的待測組分還是未知的，因此在該儀器分析條件下先對各組分進行單標確認。

在單標確認的過程中又發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：
（1） 雖然混合標準溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個*分離的色譜峰，但是對比單標色譜圖發(fā)現(xiàn)，每個單標色譜圖中都出現(xiàn)了兩個峰， 而4min附近色譜峰的峰面積和峰高幾乎 一致，很有可能是溶劑峰；
（2） 如果4min附近的色譜峰是溶劑峰，那么4種混合標準溶液色譜圖中實際上只分離出了3種組分，有一種組分沒有出峰或者與其他組分的保留時間接近；
（3） 對比葡萄糖和麥芽糖的單標色譜圖發(fā)現(xiàn)，兩者的保留時間*一致，可能是操作有誤，兩者組分在配制或在進樣時弄錯了。
針對上述問題逐一進行排查，由于所用的混合標準溶液是用水配制和稀釋的，4min附近的色譜峰是否是溶劑峰只需進一針水樣即可，因此首先以純水為樣品進行進樣測試，并且重新配制葡萄糖和麥芽糖的標準溶液并測試，配制和進樣過程及其仔細防止中間環(huán)節(jié)出錯。實驗結果表明，4min附近的色譜峰為溶劑峰（見圖4），同時重新測定后葡萄糖和麥芽糖的保留時間仍然*一致。

葡萄糖和麥芽糖的保留時間一致，考慮是否是儀器分析方法不合適導致這兩種組份沒有分離？在前面的實驗中發(fā)現(xiàn)，微調(diào)流動相比例4種糖的保留時間會有很明顯的變化，于是嘗試通過改變流動相的方式進行分離，然而實驗中發(fā)現(xiàn)改變流動相兩者的保留時間是同步變化的。實驗遇阻，就去查資料。百度一下葡萄糖和麥芽糖基本信息和結構（見圖5），兩者的分子式和結構都有很大的差別。然后去查閱文獻，發(fā)現(xiàn)采用氨基柱分離葡萄糖和麥芽糖的文獻并不少見?？磥硎侨似放c技術的問題了。

難道是色譜柱的原因？色譜柱柱效下降導致兩者不能分離？于是更換新的色譜柱再次分離，結果還是沒有能夠將兩者分離。如果葡萄糖和麥芽糖無法分離，實驗便無法進行下去，在經(jīng)過上述嘗試之后將問題的矛頭指向了所用的試劑。查試劑臺賬，發(fā)現(xiàn)實驗室里還有其他品牌分析純的葡萄糖，而麥芽糖*一瓶，但是幸運的是發(fā)現(xiàn)了葡萄糖和麥芽糖的標準品，決定使用麥芽糖和葡萄糖的標準品試一下。

實驗結果表明，采用分析純和標準品配制的葡萄糖標準溶液的出峰時間保持一致，而采用分析純和標準品配制的麥芽糖標準溶液的出峰時間出現(xiàn)了差異?？偹闶强啾M甘來找到了問題的癥結，看來這次是 “李逵”遇到了“李鬼”。重新配制4種糖的混合標準溶液，采用上述儀器分析條件進行測定時4種糖得到了較好的分離，因此繼續(xù)延用上述的儀器分析條件進行后續(xù)測定。
3.2 溶劑效應的消除
4種糖的分離和確認過程基本完成，接下來解決溶劑效應的問題。溶劑效應在液相分析中是一種很常見有時也是很讓人頭疼的現(xiàn)象，嚴重的溶劑效應可能會影響到分析結果。溶劑效應產(chǎn)生的原因和處理方法早有前輩進行過細致的講解（想了解更多可以參看帖子，這里也不過多的贅述。雖然此次的溶劑效應不會影響定性和定量，但是那“高高再上”的溶劑峰看著很難受，于是想嘗試解決或者減輕溶劑效應，降低溶劑峰的峰響應。為了減少分析時間，同時減少標準品的消耗（麥芽糖的標準品只有0.25g/瓶）決定直接用流動相中的兩相（乙腈和水）進行嘗試。通過改變乙腈和水的體積比考察溶劑峰的出峰情況。實驗發(fā)現(xiàn)，在上述色譜條件下以乙腈為樣品進行測試時溶劑峰為響應值很大的倒峰；以水為樣品進行測試時溶劑峰為響應值很大的正峰；調(diào)節(jié)兩者的比例可以改變?nèi)軇┓宓某龇迩闆r，如圖7。

從圖中可以看出， 試樣為70%乙腈和80%乙腈時溶劑峰已經(jīng)變小許多，而以流動相為樣品(75%乙腈)時溶劑效應得到了進一步的降低，也就是人們常說的，可以嘗試用流動相配制標準溶液或者定容樣品減輕溶劑效應。于是決定采用流動相配制標準溶液，然而在配制過程中又遇到了難題，高濃度糖的水溶液與乙腈不能互溶，兩者會出現(xiàn)明顯的分層，如圖8（照片拍的不是很清楚，但是可以看到一個分界線）。真是一波還未平息，一波又來侵襲?？磥聿捎昧鲃酉嗯渲茦藴嗜芤旱姆绞绞切胁煌?，于是適當提高水相的比例，當采用50%乙腈水溶液時，兩相沒有出現(xiàn)分層，同時測定時有效地降低了溶劑效應，因此在后續(xù)的標準溶液配制和樣品前處理過程中均采用50%乙腈水溶液。

3.3 基線噪音的消除
優(yōu)化完儀器分析條件并解決了溶劑效應問題之后，接下來就要解決基線噪音的問題了。液相中產(chǎn)生基線噪音的原因有：(1) 燈能量下降；（2）流通池污染；（3）泵壓不穩(wěn)；（4）氣泡等。論壇中關于基線噪音的帖子也很多，許多老師都對基線噪音產(chǎn)生的原因和消除方法進行過詳細的介紹，這里僅列舉一二。

于是按圖索驥，依據(jù)論壇中介紹的消除基線噪音的方法分別對單向閥、色譜柱、樣品池和參比池等進行維護，然后再對混合標準溶液進行測試，結果都沒有能夠得到理想的色譜圖，基線噪音依舊很大?？紤]到前期測定時流動相微調(diào)會對樣品出峰有很大影響，同時依據(jù)示差檢測器的檢測原理（示差檢測器是連續(xù)檢測樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測器），該檢測器對流動相的變化和溫度都很敏感，而實驗中流動相都是通過比例閥在線混合的方式進行的，在線混合不僅可能導致流動相組成會有微弱的差異，同時乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化，因此嘗試采用流動相預先混合的方式，即按照在線混合優(yōu)化后的比例進行預先配制流動相然后進行測試，采用該方法后基線噪音得到明顯改善。關于基線噪音消除方法將另開一貼進行詳細介紹。

3.4色譜柱的修復
經(jīng)過上述一系列的優(yōu)化和測試，蜂蜜中4種糖的測定方法基本確定，按照zui終優(yōu)化的方法進行樣品前處理、繪制標準曲線和分析測定。然而在后期的測試過程中發(fā)現(xiàn)，氨基柱的性能下降很快，峰明顯變寬，柱效降低，如圖10。系統(tǒng)適應性測試表明，經(jīng)過幾番測試后氨基柱的柱效只用新柱的約三分之一。
 

采用隨柱說明書（見圖11）提供的方法進行維護：先用20倍乙腈沖洗，接著用異丙醇過渡，然后用二氯甲烷沖洗色譜柱，zui后再用異丙醇過渡回來，用流動相沖洗、平衡色譜柱后進樣分析，測試發(fā)現(xiàn)維護后色譜柱性能并沒有多大變化。

平時實驗中C18色譜柱用的比較多，前期也對C18色譜柱進行過修復實驗并取得了很好的效果，此次也決定試一下。于是拆柱，拆開色譜柱后發(fā)現(xiàn)氨基柱的前端填料有點塌陷，于是從同款舊柱子的末端取了一些填料進行填補，同時對前端的篩板進行了清洗，如圖12。經(jīng)過填料的修補和篩板的清洗，色譜柱的柱效略有提高，但是與新柱相比還是相差甚遠。在“液相色譜之家”群中和各位老師交流以及后期的學習過程中了解到：氨基柱是在高純球形硅膠基質(zhì)上鍵合氨丙基團，采用氨基柱分析糖時通常會用到水相,而氨丙基團遇水易水解，從而導致柱效下降。當用到酸性流動相時，流動相pH值越低、流動相中水的比例越高越容易發(fā)生水解，這種損傷是不可逆的，會導致色譜柱的報廢。

4 小結
（1）實驗中之所以采用分析純的試劑配制標準儲備液是因為前期的準備工作做的不是很充分，儲備的標準品種類不全，同時標準品含量太少，不足以前期方法摸索階段的消耗，因此才會出現(xiàn)麥芽糖的“李逵”和“李鬼”事件；
（2）流動相在線混合的方式雖然會引起基線噪音，但是在前期方法摸索階段，對流動相進行優(yōu)化時還是方便可行的，可以通過此方法摸索出合適的流動相比例后再采用預混的方法進行測定；
（3）此次氨基柱維護和修復的結果都不是很成功，但是使用過程中氨基柱性能下降的問題依然存在，對氨基柱更好的使用和維護方法還在摸索階段，其他版友如有良策歡迎共同探討。